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柱式动物总蛋白提取试剂盒（细胞样品，变性提取）
Column Animal Cells Denaturing Total Protein Extraction Kit Ver.740164
货号 | 产品名称 | 规格 |
RTD8302 | 柱式动物总蛋白提取试剂盒（细胞样品，变性提取） | 50次 |
● 产品包装：
货号 | 组份 | 规格 | 贮存 |
RTD8302-01 | 变性裂解缓冲液 | 25 ml | 4℃ |
CD-50 | 离心柱套装 （包含离心柱和2 ml连盖收集管） | 50套 | RT |
● 产品简介：
本试剂盒可从动物悬浮细胞或贴壁细胞中提取总蛋白，用变性裂解缓冲液配合离心柱裂解细胞，无需超声处理打断DNA，提取过程简便高效，大约10分钟即可完成蛋白提取，可以提取到细胞内的绝大多数蛋白质（包括膜，细胞器，核，核基质和胞质蛋白）。获得的总蛋白可用于SDS-PAGE Western Blot检测、免疫沉淀（IP）等后续研究。由于裂解缓冲液中含有SDS等强变性剂，不建议用于免疫共沉淀（Co-IP）、EMSA以及酶活性分析等与蛋白活性相关的实验。
本产品提取的是细胞样品的变性总蛋白，包括质膜，细胞器，细胞核，核基质和细胞质内的蛋白，提取的蛋白不适用非变性电泳。
按照每次使用~5×106培养细胞加0.5 ml裂解缓冲液计算，本试剂盒大约可以使用50 次。
● 保存、效期及运输：
按照标签温度贮存；有效期一年；试剂盒常温运输。
● 用前必读：
1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），需要离心机转速能达到16000 g（约20000 rpm），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。
2. 变性裂解缓冲液混匀后放置于冰上。将离心柱套装盖好管盖，放置于冰上预冷。
3. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在裂解缓冲液中（添加时按照1:100添加，即1 ml裂解缓冲液 添加10 μl抑制剂）；研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。
4. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。
● 使用说明：
一. 准备即用型裂解缓冲液：
取适当体积的预冷裂解缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的蛋白酶抑制剂（100×）（自备，试剂盒不提供），如果进行蛋白磷酸化研究，需要加入1/100体积的磷酸酶抑制剂
（100×）（自备，试剂盒不提供），随后立即放于冰上待用。
二. 贴壁细胞蛋白提取：
2.1 将预冷的 1×PBS直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞，吸去上清。
2. 2 按照下表中将相应体积的变性裂解缓冲液均匀的加入整个器皿表面，用移液器吹打混匀，冰浴5分钟。
细胞类型 | 培养器皿 | 细胞数量 | 细胞沉淀体积（PCV）（μl） | 裂解缓冲液（μl） |
贴壁细胞 | 24孔板 | ~5×105 | ~5 | 50 |
6孔板 | ~2.5×106 | ~25 | 200 | |
25cm2培养瓶 | ~2×106 | ~20 | 200 | |
75cm2培养瓶 | ~8×106 | ~80 | 500 | |
35 mm培养皿 | ~2×106 | ~20 | 200 | |
60 mm培养皿 | ~5×106 | ~50 | 500 | |
100 mm培养皿 | ~1.5×107 | 调整细胞数目到2-5×106 | 200 |
注： (二百万，2×106)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。
2. 3 将裂解的细胞转移到预冷的离心柱中，4℃ 16000g 离心 1分钟。
注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如移液器不易吸取，可以将吸头剪尖，保证将全部裂解物加到离心柱中。
2. 4 弃去离心柱，将收集管中蛋白溶液转移至干净的 1.5 ml 离心管中，即可用于蛋白浓度测定和后续实验。注：如果收集管中有少许沉淀，只需收集上清即可。
三. 悬浮细胞蛋白提取：
3.1 400 g 4℃ 离心5 min收集细胞；用1 ml 1×PBS重悬细胞，400 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；留下细胞沉淀备用。
3.2 按照下表加入相应体积的变性裂解缓冲液，用移液器重悬，冰浴处理5分钟。
细胞类型 | 细胞数量 | 细胞沉淀体积（PCV）（μl） | 裂解缓冲液（μl |
悬浮细胞 | ~1×106 | ~10 | 100 |
~2×106 | ~20 | 200 | |
~5-10×106 | ＞50 | 500 |
注： (二百万，2×106)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。
3. 3 将裂解的细胞转移到预冷的离心柱中，4℃ 16000g 离心 1分钟。
注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如移液器不易吸取，可以将吸头剪尖，保证将全部裂解物加到离心柱中。
3. 4 弃去离心柱，将收集管中蛋白溶液转移至干净的 1.5 ml 离心管中，即可用于蛋白浓度测定和后续实验。注：如果收集管中有少许沉淀，只需收集上清即可。
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