MENU
快速蛋白高灵敏度染色试剂盒
产品编号 | 规格 | 贮存 |
RTD6401 | 25次 | 常温 |
● 贮存、运输及效期：
常温保存；常温运输；开封后一年有效。
● 产品简介
快速蛋白高灵敏度试剂盒是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白分离后染色的试剂盒。本试剂盒也可以用于2D凝胶的染色，并且染色后兼容后续的质谱检测。本试剂盒只需约90分钟内可以完成凝胶的染色。对于BSA蛋白，检测灵敏度可以达到0.3 ng蛋白。
本试剂盒可足够用于25块常规的8×10 cm凝胶的染色。
说明书后附有实验记录表格，方便记录实验步骤。
● 产品组成：
产品编号 | 产品名称 | 规格 | 贮存 |
RTD6401-1 | 增敏液(100×) | 26 ml | 常温 |
RTD6401-2 | 染色溶液(100×) | 26 ml | 常温，避光 |
RTD6401-3 | 基本显色液(10×) | 250 ml | 4℃ |
RTD6401-4 | 显色加速液(2000×) | 1.5 ml | 常温，避光 |
RTD6401-5 | 终止液(20×) | 125 ml | 常温 |
● 注意事项：
1. 由于该方法染色非常灵敏，操作时请注意尽量使用高纯度的水，并确保所使用的器皿非常清洁，最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套，避免皮肤和凝胶直接接触。
2. 需自备乙醇、冰醋酸及MilliQ级纯水或双蒸水。
3. 下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10 cm厚度为0.75-1 mm的凝胶。对于更大的凝胶，各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大；对于更厚的凝胶，作用时间需按照厚度的比例适当延长10-20分钟。
4. 本说明书所指的常温温为20-25℃，操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降，各步骤需适当延长时间。
5. 基本显色液(10×)在4℃低温贮存时可能会出现沉淀，可在37℃水浴中溶解，并充分混匀后使用。
● 使用方法：
一. 固定步骤：
1.1 漂洗：电泳结束后，凝胶中加入100 ml双蒸水中漂洗5分钟，重复漂洗1次，去除凝胶表面的电泳缓冲液。
1.2 固定：取漂洗后的凝胶放入约100 ml固定液中，在摇床上常温摇动20分钟，摇动速度为60-70 rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制 配制量100 ml
无水乙醇 | 冰醋酸 | 超纯水 |
50 ml | 10 ml | 40 ml |
1.3 30%乙醇洗涤：
弃固定液，加入100 ml 30%乙醇，在摇床上常温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。
30%乙醇的配制：
70 ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30 ml乙醇，混匀后即成100 ml 30%乙醇。
1.4 水漂洗：
弃30%乙醇，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动5分钟，摇动速度为60-70 rpm；重复漂洗一次。
二. 增敏步骤：
2.1 弃水，加入100 ml增敏液(1×)，在摇床上常温摇动2分钟，摇动速度为60-70 rpm。
增敏液(1×)的配制：
增敏液(100×) | 超纯水 |
1 ml | 99 ml |
注：增敏液(1×)配制后需在2小时内使用。
2.2 水漂洗(共2次)：
弃原有溶液，加入200 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动1分钟，摇动速度为60-70 rpm。 重复此步骤一次。
三. 染色步骤：
3.1 染色：
弃水，加入100 ml染色溶液(1×)，在摇床上常温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。 染色过程中，凝胶会呈微微黄色。
染色溶液(1X)的配制：
染色液(100×) | 超纯水 |
1 ml | 99 ml |
注：染色溶液(1X)配制后需在2小时内使用。
3.2 水洗涤：
弃染色溶液，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。
注意：水洗涤的时间不能超过1.5分钟。
四. 显色步骤：
弃水，加入100 ml显色液，在摇床上常温摇动3-7分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70 rpm。
显色液的配制 配制量100 ml
基本显色液(10×) | 超纯水 | 显色加速液(2000×) |
10 ml | 90 ml | 50 μl |
注：显色加速液(2000×)有刺激性气味，建议在通风橱内操作；
显色液配制后需在20分钟内使用。
五. 终止步骤：
5.1 漂洗：弃显色液，加入100 ml双蒸水在摇床上常温摇动2分钟，漂洗掉凝胶上残留的显色液。
5.2 终止染色：
弃显色液，加入100 ml终止液(1×)，在摇床上常温摇动10分钟，摇动速度为60-70 rpm。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。
终止液(1×)的配制：
终止液(20×) | 超纯水 |
5 ml | 95 ml |
注：终止液(1×)配制后应当天使用。
5.3 水洗涤：
弃终止液，加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上常温摇动5分钟，摇动速度为60-70 rpm。
六. 保存：
可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存或采用适当的方式制备成干胶。
● 常见问题：
一. 背景太深：
1.1. 步骤四显色时间过长。通常显色反应会在10分钟内结束，显色反应时间过长会导致背景很深。
1.2. 洗涤不充分。洗涤时间过短，或洗涤液加入的量不足，或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合，或摇动速度过慢，导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间，摇床的推荐速度为60-70 rpm。
1.3 步骤1.2中凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量，另一方面对于不是最常用的Bis-Tris系统的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分，以降低背景。
1.4 水的纯度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。
二. 蛋白条带非常浅：
2.1 蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于染色非常重要，半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。
2.2 步骤3.2染色后水洗涤时间过长。在染色溶液染色时需严格控制水洗涤的时间，水洗涤的时间不能超过1.5分钟，否则会导致过多的显色离子被洗去，导致检测灵敏度下降。
2.3 上样量不足。本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3 ng，对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于1 ng的蛋白量才能被检测到。
2.4步骤1.3和1.4的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留，影响后续检测。确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间，可以适当延长洗涤时间。
三. 凝胶上出现小点或其它非蛋白的痕迹：
3.1 凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器，并加入足量的各种溶液，同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。
3.2 用于染色的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤，随后用自来水充分冲洗，最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于染色，并注意避免各种可能的蛋白污染。
3.3 指纹或其它压痕。请注意戴手套操作，切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、
折叠或摩擦凝胶。
3.4 有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。
四. 在60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景：
皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开，甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。
五. 在凝胶的上半部分出现黄色背景：
5.1 样品使用了含有DTT的上样缓冲液。换用含有其它还原试剂如β-巯基乙醇的上样缓冲液。
5.2 采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致
背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。
● 实验记录表格
实验日期：
|
| 约90分钟 | 标记√ | 起始时间 |
一 固定步骤 |
|
|
|
|
| 1.1 水漂洗 | 2×5 min |
|
|
| 1.2 固定 | 20 min |
|
|
| 1.3 乙醇漂洗 | 10 min |
|
|
| 1.4水漂洗 | 2×5 min |
|
|
二 增敏步骤 |
|
|
|
|
| 2.1 增敏 | 2 min |
|
|
| 2.2 水漂洗 | 2×1 min |
|
|
三 染色步骤 |
|
|
|
|
| 3.1染色 | 10 min |
|
|
| 3.2水漂洗 | ＜1.5 min |
|
|
四 显色步骤 |
|
|
|
|
| 显色 | 3-7 min |
|
|
五 终止步骤 |
|
|
|
|
| 5.1 水漂洗 | 2 min |
|
|
| 5.2 终止 | 10 min |
|
|
| 5.3 水漂洗 | 5 min |
|
|
六 保存 |
|
|
|
|
实验示例：
發信給店家