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尿素-SDS-PAGE凝胶快速制备及电泳试剂盒
货号 | 名称 | 规格 |
RTD6163 | 尿素-SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒 | 50次 |
● 产品组成：
货号 | 名称 | 规格 | 贮存 |
AC2914-02 | 40%PAA(29:1) | 100 ml | 4℃ |
TS050-01 | 4×Tris/SDS分离胶缓冲液 pH8.8 | 100 ml | 4℃ |
TS030-01 | 4×Tris/SDS浓缩胶缓冲液 pH6.8 | 50 ml | 4℃ |
RU5080 | 尿素（电泳级） | 220 克 | RT |
AP020P | APS（干粉） | 0.5 g | RT |
TA0761-01 | TEMED | 0.5ml | 4℃，避光 |
PL080-01 | 5×MonoColor蛋白上样缓冲液(变性,还原) | 1 ml | -20℃ |
TG120P | 5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(变性电泳,粉末型) | 1 L | RT |
| 说明书 | 一份 |
|
● 贮存、效期及运输：
按照标签温度贮存；有效期一年；常温运输。
● 产品简介：
本公司提供的尿素-SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒包含凝胶制备以及蛋白电泳所需的全部试剂。在SDS-PAGE中尿素作为辅助的变性剂，能与SDS一起彻底变性蛋白，特别是一些跨膜多次的蛋白，尿素辅助SDS可以彻底打开蛋白的高级结构。该产品可以用于Blue Native电泳分离后的二向电泳，也可以用于一些碱性蛋白如组蛋白，鱼精蛋白的变性电泳分离。
本试剂盒可配制至少50块常规大小（8×10 cm）1mm厚度的PAGE胶。
● 使用说明：
一. 配制分离胶（各试剂使用量请参考表1）
1.1 配制分离胶前，根据以下配方准备10% APS溶液-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少常温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20℃保存的10%APS。
1.2按照表1将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
1.3 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
1.4 静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
表1 SDS-PAGE分离胶配方表
组份 | 不同凝胶体积对应各组份的取样量 | |||
6％ 胶 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml
| ||||
尿素 | 1.8 g | 3.6 g | 5.4 g | 7.2 g |
4×Tris/SDS分离胶buffer pH8.8 | 1.25 ml | 2.5 ml | 3.75 ml | 5 ml |
40％ PAA（29:1） | 0.75 ml | 1.5 ml | 2.25 ml | 3 ml |
H2O | 定容至5ml | 定容至10 ml | 定容至15 ml | 定容至20 ml |
TEMED | 0.005 ml | 0.01 ml | 0.015 ml | 0.02 ml |
10％ APS | 0.05 ml | 0.1 ml | 0.15 ml | 0.2 ml |
8％ 胶 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml | ||||
尿素 | 1.8 g | 3.6 g | 5.4 g | 7.2 g |
4×Tris/SDS分离胶buffer pH8.8 | 1.25 ml | 2.5 ml | 3.75 ml | 5 ml |
40％ PAA（29:1） | 1 ml | 2 ml | 3 ml | 4 ml |
H2O | 定容至5ml | 定容至10 ml | 定容至15 ml | 定容至20 ml |
TEMED | 0.005 ml | 0.01 ml | 0.015 ml | 0.02 ml |
10％ APS | 0.05 ml | 0.1 ml | 0.15 ml | 0.2 ml |
10％ 胶 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml | ||||
尿素 | 1.8 g | 3.6 g | 5.4 g | 7.2 g |
4×Tris/SDS分离胶buffer pH8.8 | 1.25 ml | 2.5 ml | 3.75 ml | 5 ml |
40％ PAA（29:1） | 1.25 ml | 2.5 ml | 3.75 ml | 5 ml |
H2O | 定容至5ml | 定容至10 ml | 定容至15 ml | 定容至20 ml |
TEMED | 0.005 ml | 0.01 ml | 0.015 ml | 0.02 ml |
10％ APS | 0.05 ml | 0.1 ml | 0.15 ml | 0.2 ml |
12％ 胶 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml | ||||
尿素 | 1.8 g | 3.6 g | 5.4 g | 7.2 g |
4×Tris/SDS分离胶buffer pH8.8 | 1.25 ml | 2.5 ml | 3.75 ml | 5 ml |
40％ PAA（29:1） | 1.5 ml | 3 ml | 4.5 ml | 6 ml |
H2O | 定容至5ml | 定容至10 ml | 定容至15 ml | 定容至20 ml |
TEMED | 0.005 ml | 0.01 ml | 0.015 ml | 0.02 ml |
10％ APS | 0.05 ml | 0.1 ml | 0.15 ml | 0.2 ml |
15％ 胶 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml | ||||
尿素 | 1.8 g | 3.6 g | 5.4 g | 7.2 g |
4×Tris/SDS分离胶buffer pH8.8 | 1.25 ml | 2.5 ml | 3.75 ml | 5 ml |
40％ PAA（29:1） | 1.875 ml | 3.75 ml | 5.625 ml | 7.5 ml |
H2O | 定容至5ml | 定容至10 ml | 定容至15 ml | 定容至20 ml |
TEMED | 0.005 ml | 0.01 ml | 0.015 ml | 0.02 ml |
10％ APS | 0.05 ml | 0.1 ml | 0.15 ml | 0.2 ml |
二. 浓缩胶制备：
2.1 去除覆盖在分离胶上的水层。
2.2 按照表2将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
2.3 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
2.4 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
2.5 静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。
表2 SDS-PAGE浓缩胶(4%)配方表
组份 | 不同凝胶体积对应各组份的取样量 | |||
2 ml | 4 ml | 5 ml | 10 ml | |
尿素 | 0.72 g | 1.44 g | 1.8 g | 3.6 g |
4×Tris/SDS浓缩胶buffer pH6.8 | 0.5 ml | 1 ml | 1.25 ml | 2.5 ml |
40％ PAA（29:1） | 0.2 ml | 0.4 ml | 0.5 ml | 1 ml |
H2O | 定容至2 ml | 定容至4 ml | 定容至5 ml | 定容至10 ml |
TEMED | 0.002 ml | 0.004 ml | 0.005 ml | 0.01 ml |
10％ APS | 0.02 ml | 0.04 ml | 0.05 ml | 0.1 ml |
三. 电泳：
3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液的配制-1 L：
将一包5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
3.2 电泳：
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。上样，电泳，一般是浓缩胶80V，分离胶120V恒压，等指示前沿溴酚兰电泳到分离胶下缘后，结束电泳，染色或者进行下一步实验。
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