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碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒
Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit
货号 | 名称 | 规格 |
RTD6131 | 碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒 | 50次 |
● 产品组成：
序号 | 货号 | 名称 | 规格 | 保存条件 |
1 | AC2913-01 | 30%PAA(29:1) | 100 ml | 4℃，避光 |
2 | RTD6131-02 | 4×碱性蛋白分离胶缓冲液 pH4.3 | 100 ml | 4℃ |
3 | RTD6131-03 | 4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8 | 50 ml | 4℃ |
4 | RTD6131-04 | 100×分离胶促凝剂 | 2.5 ml | -20℃ |
5 | AP020P | APS（干粉） | 5 ml | RT |
6 | TA0761-01 | TEMED | 0.5 ml | 4℃，避光 |
7 | PL110 | 5×甲基绿上样缓冲液 | 1 ml | -20℃ |
8 | TG160P | 5×碱性蛋白电泳缓冲液（干粉） | 1 L | RT |
● 产品简介：
本公司提供的试剂盒包含碱性蛋白凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水。本试剂盒可用于配制碱性蛋白非变性(native)PAGE凝胶。本试剂盒可配制30-50块常规大小的非变性PAGE胶。
各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质称为碱性蛋白质，等电点偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性。分离碱性蛋白时候，要利用低 pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高 pH 凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的 pH 是 8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
特别说明：
1. 由于本系统采用非连续凝胶系统，分离胶pH为4.3，因此要求待分离的蛋白等电点pI＞7.0，这样碱性蛋白在酸性凝胶系统内带正电荷，在凝胶电泳中才能正常向阴极泳动。如果待分离的蛋白等电点pI＜7.0，请选择非连续Laemmli活性凝胶系统分离（货号：RTD6130）。
2. 本试剂盒不适用于总蛋白样品的电泳，也不适用于总蛋白分离后的Wstern Blot检测；推荐应用于纯化后蛋白的碱性蛋白电泳。
● 保存及运输：
按照标签温度贮存；常温运输；开封后一年有效。
● 使用说明：
一 配制分离胶
根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度（表一），配制非变性PAGE的分离胶。
表一 不同浓度的PAGE分离胶的最佳分离范围
PAGE分离胶浓度 | 最佳分离范围 |
6% | 50-150kD |
8% | 30-90kD |
10% | 20-80kD |
12% | 12-60kD |
15% | 10-40kD |
配制分离胶前，根据以下配方准备10% APS：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
制备分离胶步骤：
1．根据下表，将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡
2．在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
3．静置15-30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
表二 配制不同浓度分离胶所需各组分的体积(毫升)
组份 | 6% 分离胶 5 ml | 8% 分离胶 5 ml | 10% 分离胶 5 ml | 12% 分离胶 5 ml | 15% 分离胶 5 ml |
灭菌水 | 2.7 | 2.4 | 2 | 1.7 | 1.2 |
4×分离胶缓冲液 pH4.3 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 |
30％ PAA（29:1） | 1 | 1.3 | 1.7 | 2 | 2.5 |
100×分离胶促凝剂 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
TEMED | 0.005 | 0.005 | 0.005 | 0.005 | 0.005 |
10％ APS | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
二 浓缩胶制备：
1．去除覆盖在分离胶上的水层。
2．按照表三将不同成分在一个小烧杯或试管中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
3．将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
4．将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
5．静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
表三 碱性蛋白Native PAGE浓缩胶(5%)配方表
组份 | 5%浓缩胶（2 ml） |
H2O | 1.15 |
4×碱性蛋白浓缩胶缓冲液 pH6.8 | 0.5 |
30％ PAA（29:1） | 0.33 |
TEMED | 0.002 |
10％ APS | 0.02 |
三 电泳：
凝胶凝固好后，根据以下配方准备电泳缓冲液。
5×碱性蛋白电泳缓冲液的配制-1 L：将5×碱性蛋白电泳缓冲液干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，加入冰醋酸11ml，用水定容至1 L，即配成5×碱性蛋白电泳缓冲液（此溶液pH值约为4.4）。
将5×碱性蛋白电泳缓冲液稀释5倍即配成1×碱性蛋白电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×碱性蛋白电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×碱性蛋白电泳缓冲液。上样，把电泳电源的电源线互换，即红色的阳极电极查到阴极孔，黑色的阴极电极插到阳极孔，按照表四条件，电泳，等指示前沿甲基绿电泳到分离胶下缘后，结束电泳，染色或者进行下一步实验。
表四 碱性蛋白电泳条件
恒电压 | 150V |
起始电流 | 30-40mA/板胶 |
结束电流 | 10-20mA/板胶 |
电泳时间 | 40-45分钟 |
实验示例：
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