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明胶酶谱分析试剂盒
Gelatin Zymography Analysis Kit Ver.710278
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货号 |
名称 |
规格 |
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RTD6143 |
明胶酶谱分析试剂盒 |
50次 |
● 产品组成：
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货号 |
名称 |
规格 |
保存 |
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RTD6143-01 |
4%浓缩胶聚合溶液A（2×） |
40 ml |
4℃ |
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RTD6143-02 |
4%彩色浓缩胶溶液B（2×） |
40 ml |
4℃ |
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RTD6143-03 |
10%分离胶聚合溶液A（2.5×） |
100 ml |
4℃ |
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RTD6143-04 |
10%分离胶胶溶液B（2×） |
125 ml |
4℃ |
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RTD6143-05 |
10×明胶底物 |
30 ml |
RT (配制后-20℃) |
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RTD6143-06 |
10×复性缓冲液 |
250 ml |
4℃ |
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RTD6143-07 |
10×孵育缓冲液 |
500 ml |
4℃ |
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RTD6143-08 |
胶原酶阳性对照 |
0.5 ml |
-20℃ |
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RTD6202 |
FastBlue蛋白染色液 |
500 ml |
RT |
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PL112 |
5×蛋白上样缓冲液 (变性，非还原) |
1 ml |
-20℃ |
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TG120P |
5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(干粉) |
1 L |
RT |
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AP020P |
APS（干粉） |
0.5 g |
RT (配制后-20℃) |
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TA0761 |
TEMED |
0.5 ml |
4℃，避光 |
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说明书 |
一份 |
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● 产品简介：
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）是一种锌依赖性酶，能切割细胞外基质成分，能在一定条件下水解明胶。细胞内的MMP以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，通过影响细胞外基质，参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。
本试剂盒采用酶谱法（Zymography）检测MMP-2、MMP-9 活性，其基本原理和程序是：制备含有胶原酶底物明胶的SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳时，SDS与样本中的MMP可逆性结合，导致MMP氢键和疏水键被破坏而不能发挥分解明胶的作用。电泳结束后取出凝胶与孵育溶液孵育，MMP恢复活性，在其迁移位置水解凝胶中的明胶，考马斯亮蓝染色后凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮白色区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶谱）及活性，其强弱与MMP活性呈正比。
本试剂盒提供明胶酶谱分析的全套试剂，试剂盒可进行50 次标准胶（8×10 cm）检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750 个样品。试剂盒配套有胶原酶阳性对照，可以有效分解明胶，方便判断凝胶及电泳体系是否有问题。
● 贮存及运输：
按照试剂盒标签贮存；常温运输；开封后试剂盒有效期一年。
● 使用说明：
1. 10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10%APS。
2. 10×明胶底物配制：
明胶粉末加入30 ml灭菌水，60℃水浴中彻底融化，冷却至常温后使用。明胶底物配制后-20℃贮存。
一 分离胶制备：
1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2按照表格将不同体积的成分在小烧杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
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10%分离胶 |
4%浓缩胶 |
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5 ml |
1.6 ml |
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加入顺序 |
组份 |
1.0 mm厚度凝胶 |
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1 |
10%分离胶聚合溶液A（2.5×） |
2.0 ml |
- |
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2 |
10%分离胶胶溶液B（2×） |
2.5 ml |
- |
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3 |
10×明胶底物 |
0.5 ml |
- |
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4 |
4%浓缩胶聚合溶液A（2×） |
- |
0.8 ml |
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5 |
4%彩色浓缩胶溶液B（2×） |
- |
0.8 ml |
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6 |
10％ APS |
50 μl |
16 μl |
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7 |
TEMED |
5 μl |
1.6 μl |
1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层无水乙醇，使凝胶表面保持平整。
1.4静置5-10分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合
二 浓缩胶制备：
2.1去除覆盖在分离胶上的乙醇层。
2.2按照表格将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
2.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
2.4将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
2.5静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合（25℃ 标准凝固时间为50分钟）。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表格标准条件调节催化剂的加入量。
三 电泳：
3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液的配制：
将一包干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L（此溶液不用调节pH值，pH 8.3-8.5）。电泳前将缓冲液稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
3.2 样品处理：融化-混合-上样
3.2.1 将5×蛋白上样缓冲液（变性，非还原）常温融化后混匀。
3.2.2 将上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀。
注：由于MMP活性需要二价阳离子，蛋白样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等。
蛋白样品提取可以选择RL0120F RIPA裂解液(强，不含抑制剂，不含螯合剂)
3.2.3 快甩离心收集到管底，常温放置5-10分钟，不要加热处理样品，上样电泳。
胶原酶阳性对照同时上样5-10 μl。
3.3 电泳：
在电泳槽的内槽加入1×电泳缓冲液，轻轻拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×电泳缓冲液。上样，恒电压150 V电泳。
电泳条件（一板胶）
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恒电压 |
起始电流 |
终止电流 |
电泳时间 |
可选 |
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150V |
30-40mA |
8-15mA |
50 min+ |
冰浴电泳 |
四 MMP检测：
4.1 漂洗：
取出凝胶，放入容器内，加入50 ml蒸馏水漂洗凝胶，摇床慢摇5分钟，重复一次。
4.2 复性：
4.2.1 1×复性缓冲液配制：
将10×复性缓冲液用蒸馏水稀释10倍，如10 ml 10×复性缓冲液加90 ml蒸馏水。
注：如10×复性缓冲液由于低温贮存有析出时，37℃彻底溶化后再使用。
4.2.2 复性：
取出凝胶，弃蒸馏水，加入50 ml 1×复性缓冲液，摇床慢摇30分钟。
注：复性结束后，凝胶呈乳白半透明状。
4.3 孵育：
4.3.1 1×孵育缓冲液配制：
将10×孵育缓冲液用蒸馏水稀释10倍，如10 ml 10×孵育缓冲液加90 ml蒸馏水。
4.3.2 孵育：
倒掉1×复性缓冲液，加入50 ml 1×孵育缓冲，37℃ 摇床慢摇10分钟；
弃1×孵育缓冲液，加入 50 ml 1×孵育缓冲，37℃ 摇床慢摇4小时-过夜孵育。
注：阳性对照-胶原酶IV通常37℃孵育3-4小时即可消化凝胶中的明胶。如样品中MMP 活性低，应延长孵育时间至过夜。
4.4 显色：
4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝胶中加入50 ml蒸馏水，摇床慢摇5分钟，重复一次。
4.4.2 弃蒸馏水，加入50 ml FastBlue染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），摇床上常温摇动30分钟-2小时，凝胶大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域；蒸馏水漂洗2-3次，每次5-10分钟。
4.5 拍照：
由于考马斯亮蓝染色，凝胶背景为蓝色，自然光下拍照效果不好。建议使用凝胶观察透射灯（货号：RT3820）底部打光拍照。
五 实验示例：
10%分离胶（含明胶底物）
电泳条件：1×TGS 150V 36-12mA 90 min
实验步骤：
漂洗：蒸馏水漂洗两次；
复性：50 ml 1×复性缓冲液常温复性30分钟；
孵育：50 ml 1×孵育缓冲液37度孵育10分钟；
50 ml 1×孵育缓冲液37度孵育15小时；
漂洗：蒸馏水漂洗两次；
染色：FastBlue染色60分钟。
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