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10×BN转膜缓冲液
产品编号 | 产品名称 | 规格 |
BC600P | 10×BN转膜缓冲液（粉末） | 1升 |
● 简介：
10×BN转膜缓冲液（10×Blue Native Transfer Buffer）适用于BN蛋白电泳后凝胶上非变性蛋白的转膜。本转膜液配制便捷，稀释后无需调节pH值，pH约为7.5-7.7。该缓冲液最终可配成10升即用型1×缓冲液（根据需求补加甲醇）。
● 保存和运输：
粉末装常温保存，常温运输，两年有效；配成10×转膜缓冲液后4℃贮存，一年有效；加入甲醇的即用型转膜缓冲液4℃贮存，一个月有效。
● 配制方法：
将10×转膜缓冲液粉末全部溶解于1升超纯水中，彻底溶解，即配成10×转膜缓冲液。
根据下表配制成1×即用型转膜缓冲液
| 1×即用型转膜缓冲液 | ||
| 500 ml | 1 L | 2 L |
10×转膜缓冲液 | 50 ml | 100 ml | 200 ml |
无水甲醇 | 甲醇终浓度0-20% | ||
超纯水 | 定容至 500 ml | 定容至 1升 | 定容至 2升 |
| 不要调节pH | ||
注：转膜缓冲液中加入甲醇对蛋白有固定作用，转膜分子量较大的蛋白少加或不加甲醇，转膜分子量较小的蛋白要加至多20%的甲醇。非变性蛋白的转膜可以不加甲醇。
● 使用方法：
1. BN电泳介绍：
Blue Native PAGE（BN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离。BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）。BN电泳可以选择Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒(U型板3-12%预制胶，通用型)（货号：RTD6139-0312或RTD6139-0416）
2. 电泳后凝胶预处理（可选步骤）：
凝胶浸泡于适量1×即用型BN转膜缓冲液（加终浓度0.1% SDS）中，摇床慢摇10分钟。
注：凝胶浸泡在含SDS缓冲液中，能让蛋白带上更多的负电荷，有利于蛋白的转膜。
3. 转膜：
3.1转膜方法：BN电泳后的转膜建议用湿转法。
3.2膜的选择：BN电泳转膜必须使用PVDF膜，不能用NC膜（NC膜会与考马斯亮蓝G-250不可逆结合，很难清除干净）。根据蛋白大小选择膜的孔径。一般说来，大于20 kD蛋白选择0.45 μm孔径，低于20 kD选择0.22 μm孔径。PVDF膜使用前要用无水甲醇润湿活化。
3.3 三明治结构：转膜三明治结构与传统转膜相同，即根据“黑胶白膜”制作三明治，即膜置于转膜夹芯正极一侧，凝胶置于转膜夹芯负极一侧，这样凝胶上带负电荷的蛋白才能转移到膜上。
蛋白转膜三明治制作：
负极（电转夹黑色面）-海绵垫-1层1 mm厚度滤纸-凝胶-膜-1层1 mm厚度滤纸-海绵垫-正
极（电转夹白色面）
3.4 转膜条件：
由于在非变性条件下，不同蛋白的空间结构，聚合状态，电荷数量都有不同，以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1-2次预实验后，确定最佳的转膜条件。
蛋白大小 | 稳流 | 建议时间 | 降温措施 |
低于70kD | 150 mA | 1 小时 | 不需要 |
70-300 kD | 200 mA | 1.5-2 小时 | 需要 |
高于300 kD | 200 mA | 2.5-3.5 小时 | 需要 |
4. 洗膜：
PVDF膜用无水甲醇清洗10分钟，彻底去除蓝色G250。
5. 进行后续WB操作：封闭-一抗-二抗-检测。
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