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RIPA裂解液(强，不含抑制剂，不含螯合剂)
● 产品包装：
产品编号 | 产品名称 | 包装 | 说明书 |
RL0120F | RIPA裂解液(强，不含抑制剂，不含螯合剂) | 100 ml | 1份 |
● 产品简介：
RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。该RIPA裂解液(强)的主要成分为50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，不含蛋白酶抑制剂，不含磷酸酶抑制剂，不含螯合剂如EDTA或EGTA，可适用于明胶酶谱实验的蛋白提取。使用前根据实验需要添加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂以及EDTA或EGTA。
用该RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定蛋白浓度。
● 保存、效期及运输：
-20℃保存，有效期一年，湿冰运输。
● 注意事项：
1.为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。需自备PMSF。裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
2. RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属常见现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测与基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
● 使用说明：
1. 准备RIPA裂解液：
融解RIPA裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入1/100体积的100 mM PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。
注：进行明胶酶谱实验提取蛋白样品时，不要添加EDTA或EGTA，以免螯合掉MMP活性需要的二价阳离子；蛋白酶抑制剂也要选择性添加，不要添加金属蛋白酶抑制剂，可以添加PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）。
2. 细胞蛋白提取：
2.1 贴壁细胞：去除培养液，加入适量1×PBS，轻柔漂洗一遍，不要扰动贴壁细胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解细胞5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5 ml离心管中，冰上继续裂解15分钟，间歇混匀。
培养板规格/培养皿表面积 | 细胞量 | RIPA推荐使用量 |
100 mm培养皿 | 1.5×107 | 0.5-1 ml |
60 mm培养皿 | 5×106 | 0.25-0.5 ml |
35 mm培养皿 | 2×106 | 0.2-0.4 ml |
6孔板 | 2.5×106 | 100-200 μl |
24孔板 | 5×105 | 100-150 μl |
96孔板 | 1×105 | 50-100 μl |
2.2 悬浮细胞：450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；用适量1×PBS重悬细胞，450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；按照细胞沉淀体积（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混匀细胞沉淀，冰浴处理15分钟，间歇混匀。
注：2×106 Jurkat细胞，其细胞沉淀体积（PCM，Packed Cell Volume）大约为20 μl。
2.3 裂解细胞：
裂解混合物超声波处理（超声条件根据仪器调整，建议条件为）；如没有超声破碎仪，可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次，以彻底裂解细胞。冰浴处理15分钟。
注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如不进行超声或针头裂解处理，会导致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和纯度。
2.4 离心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 组织样品蛋白提取：
3.1 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸
干组织表面液体，将组织切成细小的碎片。
3.2 按照每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次，收集匀浆后的裂解混合物，超声波处理（超声条件根据仪器调整，建议条件为）；如没有超声破碎仪，可以使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次，以彻底裂解细胞。裂解物冰浴处理15分钟。
注：裂解中细胞会释放出变性的核酸，呈团状粘稠透明样，如不进行超声或针头裂解处理，会导致裂解物非常粘稠，大大降低蛋白提取的得率和纯度。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
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