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RealPAGE Native BN/CN 预制胶(U型板，通用型，12孔)
RealPAGE Native BN/CN Precast Gels(U Type Plate,Universal,12 Wells)
● 货品规格：
货号 | 名称 | 分离范围 | 规格 | 保存 |
RTD6138-0312 | 3-12% RealPAGE Native BN/CN 预制胶 (U型板，通用型，12 孔) | 30-10000 kD | 10板 | 4℃ |
RTD6138-0416 | 4-16% RealPAGE Native BN/CN 预制胶 (U型板，通用型，12 孔) | 15-1000 kD | 10板 | 4℃ |
● 产品简介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10000 kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。
本产品可以用于分离分子量在 10 kD-10000 kD 的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。
● 运输和贮存：
本产品常温运输；凝胶4-8℃贮存，不要冷冻；有效期12个月。
● 使用说明：
1. 样品制备：
该产品不含样品制备的相关试剂，根据样品种类选择不同提取方法。植物类囊体BN样品制备可以选择植物类囊体膜提取试剂盒（货号:RTU5002）；动物总蛋白BN样品制备可以选择
动物胞浆活性蛋白提取试剂盒(货号:RTD8106)；动物膜蛋白BN样品制备可以选择动物膜蛋白提取试剂盒（货号:RTD8111,RTD8112）；动物线粒体BN样品制备可以选择动物线粒体提取试剂盒（货号:RTD8115和RTD8116)。
2. 电泳：
2.1 拆开预制胶包装，将预制胶安装在合适的电泳槽中。
注：伯乐Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列电泳槽请确保密封条的安装方向（下图）。
六一其他系列，君意东方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等电泳槽可以直接使用预制胶。
不兼容Thermol系列电泳槽。
2.2 准备电泳缓冲液：
将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液（干粉）溶于500 ml灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
2.2.1 CN-PAGE电泳：
阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。
2.2.2 BN-PAGE电泳：
阳极缓冲液使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，阴极缓冲液按照下表配制：
| 1×蓝色阴极缓冲液 |
| 150 ml |
10×BN/CN PAGE电泳缓冲液 | 15 ml |
2% G-250 染料（电泳用） | 1.5 ml |
超纯水 | 定容至150 ml |
2.3准备样品：
2.3.1 CN-PAGE电泳：
总体积 | 10 μl |
蛋白样品 | x μl |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2.5 μl |
超纯水 | 补至10 μl |
| 不要加热 |
2.3.2 BN-PAGE电泳：
2.3.2.1 植物类囊体膜蛋白电泳：
总体积 | 10 μl |
| 含去垢剂样品* |
植物类囊体膜蛋白样品 （2%DDM增溶） | x μl |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2.5 μl |
5% G-250染料（蛋白上样） | 1 μl |
超纯水 | 补至10 μl |
| 不要加热 |
*植物类囊体膜蛋白电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：
植物类囊体样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。例如样品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为2%，则需要G-250终浓度为0.5%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料1 μl。
2.3.2.2 动物线粒体BN样品电泳：
总体积 | 10 μl |
| 含去垢剂样品* |
动物线粒体BN样品 （1%DDM增溶） | x μl |
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2.5 μl |
5% G-250染料（蛋白上样） | 0.25 μl |
超纯水 | 补至10 μl |
| 不要加热 |
*动物线粒体BN样品电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：
动物线粒体BN样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/8。例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.125%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
2.4电泳过程；
2.4.1 CN-PAGE电泳：
电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
CN-PAGE电泳 | |||
恒电压 | 起始电流 | 结束电流 | 电泳时间 |
120V | 10-15mA/板胶 | 4-10mA/板胶 | 50+min |
注：冰浴电泳 | |||
2.4.2 BN-PAGE电泳：
BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达凝胶1/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。
BN-PAGE电泳条件（一板胶）
恒电压 | 起始电流 | 电泳时间 | 缓冲液 |
|
120 V | 8-15 mA | 20-25 min | 1×蓝色阴极缓冲液 | 冰浴电泳 |
指示前沿至凝胶顶部三分之二处，更换内槽缓冲液为1×BN/CN 电泳缓冲液 |
恒电压 | 继续电泳时间 | 结束电流 | 缓冲液 |
|
120 V | 45 min + | 3-5 mA | 1×BN/CN电泳缓冲液 | 冰浴电泳 |
3. 转膜：
BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密，不易去除。转膜后PVDF膜上的蓝色染料可以用无水甲醇漂洗去除。转膜缓冲液推荐使用10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）。
4. 染色：
4.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。
4.2 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。
4.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
4.4 观察保存结果。
5. 实验示例：
BN-PAGE 3-12% Precast Gel
稳压120V 1.5 h 1×BN/CN电泳缓冲液 冰浴电泳
恒压 120V 2 h 1×BN/CN电泳缓冲液 冰浴电泳
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