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糖蛋白染色试剂盒
产品编号 | 规格 | 运输 |
RTD6501 | 10次 | RT |
● 产品简介：
本产品用于PAGE 凝胶或蛋白免疫印记硝酸纤维素膜上糖蛋白的检测。整个染色2.5小时完成。染色后的糖蛋白为品红色条带，背景为浅粉色或者无色。该试剂盒检测的灵敏度一般可以达到微克级别，但实际灵敏度跟靶蛋白糖基化程度相关，可以用于 SDS-PAGE 和2D电泳的凝胶检测，也可以用于琼脂糖凝胶电泳的检测（但背景较高），还可以用于硝酸纤维素印迹膜的检测。
按照每次使用25 ml糖蛋白染色试剂计算，本产品可以染色 8-10块mini-PAGE（8×10cm）胶或印迹膜。
● 产品组成：
产品编号 | 产品名称 | 规格 | 贮存 | 运输 |
RTD6501-1 | 氧化试剂 | 2.5 g | 常温避光 | RT |
RTD6501-2 | 糖蛋白染色试剂 | 250 ml | 常温避光 | RT |
RTD6501-3 | 还原试剂 | 1.25 g | 常温避光 | RT |
RTD6501-4 | 阳性对照（辣根过氧化物酶） | 1 mg | -20℃ | RT |
RTD6501-5 | 阴性对照（大豆胰蛋白酶抑制剂） | 1 mg | -20℃ | RT |
PL080 | 5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液 | 1 ml | -20℃ | RT |
- | 250ml棕色塑料瓶 | 2个 | - | - |
- | 说明书 | 1份 | - | - |
● 储存条件
按照标签温度贮存，常温运输。开封后一年有效。
●实验前准备：
1. 配制 3%醋酸溶液：将 15 ml 自备的冰醋酸与 485 ml 超纯水混匀，常温保存备用。
2. 配制 50%甲醇溶液：将 250 ml 甲醇与 250 ml 超纯水混匀，常温保存备用。
3. 配制氧化试剂溶液： 将本试剂盒提供的氧化试剂干粉转移到本试剂盒提供的250ml空塑料瓶中， 然后加入250 ml的超纯水，充分混匀溶解后得到氧化试剂溶液，常温保存备用。
4. 配制还原试剂溶液： 将本试剂盒提供的还原试剂干粉转移到本试剂盒提供的 250ml 空塑料瓶中，然后加入 250 ml的超纯水，充分混匀溶解后得到还原试剂溶液，常温保存备用。
5. 配制1×SDS-PAGE上样缓冲液：取0.4 ml 5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液，加入1.6 ml超纯水，-20℃贮存备用。
6. 配制阳性对照（辣根过氧化物酶）溶液：向装有 1 mg 辣根过氧化物酶固体的棕色管中加入 1 ml 1×SDS-PAGE 上样缓冲液，所得辣根过氧化物酶溶液的浓度即为 1mg/ml，然后适量分装成8-10管， 留下一管当天使用， 其余的放-20℃长期保存。 对于 8×10 cm的凝胶来说，每条泳道加 10 μl 的阳性对照溶液即可，上样前95℃处理5分钟。
7. 配制阴性对照（大豆胰蛋白酶抑制剂）溶液：向装有 1 mg 大豆胰蛋白酶抑制剂干粉的管中加入 1×SDS-PAGE 上样缓冲液（自备），所得大豆胰蛋白酶抑制剂溶液的浓度即为 1 mg/ml，然后适量分装成8-10管， 留下一管当天使用，其余的放-20℃长期保存。对于 8×10 cm的凝胶来说，每条泳道加 10 μl 的阳性对照溶液即可，上样前95℃处理5分钟。
8. 样品稀释：用 5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液将样品浓度稀释为 1 mg/ml，SDS-PAGE 上样缓冲液终浓度为 1×。对于 8×10 cm的凝胶来说，每条泳道加 5-10 μl 的样品即可，上样前95℃处理5分钟。。
● 凝胶染色的操作步骤（膜染色从步骤3开始）：
注意事项：
1.以下步骤仅针对0.75mm厚度大小8×10cm的凝胶，1-1.5mm厚度凝胶或更大体积凝胶适当增加液体体积并延长操作时间。
2. 请在通风橱中进行以下操作。
一. 固定：
取出电泳后的 SDS-PAGE 凝胶，在50 ml 50%甲醇溶液中，摇床慢摇30分钟，弃甲醇溶液。
二. 漂洗：
50 ml超纯水洗涤凝胶两次，每次摇床慢摇10分钟，弃超纯水。
三. 氧化：
凝胶中加入 25 ml 氧化试剂，摇床慢摇15分钟，弃溶液。
四. 漂洗：
50 ml超纯水洗涤凝胶3次，每次摇床慢摇5分钟，弃溶液。
五. 染色：
凝胶中加入25 ml糖蛋白染色试剂，摇床慢摇15 分钟，糖蛋白会在5-10分钟内显现品红色。若检测的糖蛋白含量较低，适当延长显色时间。弃染色溶液。
注：若糖蛋白染色试剂中有晶体析出，只需取上清液即可，不要加热溶解晶体。
染色步骤会产生有刺激性气味气体，请在通风橱中操作。
六. 还原：
凝胶中加入 25 ml 还原试剂，摇床慢摇15分钟，弃溶液。此时凝胶背景略带红色。
七. 漂洗：
加入50 ml 3%醋酸溶液摇床慢摇洗涤胶块3次，每次10分钟，直至胶背景红色变浅，接近淡红色或无色，此时红色糖蛋白主带清晰可见。
八. 保存：
胶块保存在50 ml 3%醋酸溶液中。
● 实验记录表格
实验日期：
编号 | 步骤 | 体积 | 时间 |
|
| 凝胶尺寸 8×10 cm | 0.75mm胶或膜 |
1 | 固定 | 50 ml | 30 min 膜从步骤3开始 |
2 | 漂洗 | 2×50 ml | 2×10 min |
3 | 氧化 | 25 ml | 15 min |
4 | 漂洗 | 3×50 ml | 3×5 min |
5 | 染色 | 25 ml | 15 min或更长 条带变为品红色 |
6 | 还原 | 25 ml | 5 min |
7 | 漂洗 | 3×50 ml | 3×10 min 漂洗后凝胶背景变浅 |
8 | 保存 | 50 ml | - |
实验示例：
蛋白转到NC膜后糖蛋白染色
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